لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 23
مجله دانشکده پزشکی
دانشگاه علوم پزشکی تهران
سال 63، شماره 10، صفحات 791 تا 813 (1384)
ژنتیک مولکولی و ژن درمانی در بیماریهای میتوکندریایی
(مقاله مروری)
چکیده
پس از کشف اولین بیماری مرتبط با اختلال در ژنوم میتوکندری در اواخر سال های 1980 تاکنون، شمـــــــار بیماری های مرتبط با نقص در ژنوم میتوکندریایی رو به افزایش است. با وجود پیشرفت های بی شمار در فهم اختلالات میتوکندریایی چه در سطح ژنتیکی و چه در سطح بیوشیمایی، هنوز درمان رضایت بخشی برای اکثر این بیماران وجود ندارد. بخش عمده ای از این مسئله به این دلیل می باشد که اکثریت این بیماران دارای نقص در زنجیره تنفسی می باشند که مسئول تولید انرژی می باشد و تاکنون هیچ راه فرعی برای رساندن انرژی به این افراد ازطریق مصنوعی شناخته نشده، درنتیجه اکثر توجه ها به سوی ژن درمانی این بیماری ها معطوف بوده است. در حال حاضر، سه راهکار برای ژن درمانی بیماری های میتوکندریایی وجود دارد: مهار تکثیر ژنوم معیوب با استفاده از فناورری آنتی سنس، معرفی ژن سالم به میتوکندری و معرفی ژن سالم به هسته با هدف انتقال محصول پروتئینی ژن سالم به میتوکندری. هر گونه موفقیتی در ژن درمانی میتوکندری بستگی به دردست بودن ناقالین مناسب اختصاصی برای میتوکندری می باشد. در مقاله مروری حاضر با استفاده از منابع جدید و معتبر فراوان به معرفی روش های جدید ژن درمانی و سیستمهای موجود برای رها شدن اختصاصی ژن به میتوکندری پرداخته شده است. ناقلین اختصاصی میتوکندری باید دارای دو ویژگی باشند: باید ژن موردنظر را به طور اختصاصی درمیتوکندری رها کنند وازطرفی نباید آن را درطول آندوسیتوز رها سازند. مدت های طولانی است که می دانیم ترکیبات آمفی فیل دارای مرکز باردار کاتیونی چون ردامین 123و دکوالینیوم دارای تجمع داخل میتوکندریایی می باشند. این ترکیبات دارای چربی دوستی کافی همراه با مرکز باردار مثبت هستند. خاصیتی که موجب کاهش تغییرات انرژی آزاد به هنگام انتقال از محیط آبی به محیط هیدروفوب می شود و به هنگام عبور از غشاء میتوکندری به منظور تجمع در میتوکندری مورد نیاز می باشد. اخیرا ناقلی معرفی شده است که از دکوالینیوم ساخته شده و به همین نام نیز نامیده می شود. مطالعات نشان داده است که این ناقل به ژن موردنظر متصل شده و آن را از حمله نوکلئازها محافظت می کند. با توجه به ویژگی ذاتی این ماده برای تجمع در میتوکندری به نظـــــر می رسد که این ناقل می تواند به منظور رهاسازی اختصاصی ژن ها در میتوکندری استفاده شود.
مقدمه
میتوکندری نخستین بار، حدود یکصد سال پیش توسط Altman مشاهده شد. او آن را اندامگان ابتدایی ( elementary organism) نامید و میتوکندری را اندامگانی بازندگی آزاد که درسلول قرار گرفته است توصیف کرد. جالب توجه است که اغلب شواهد امروزی ، این نظریه را تقویـــت کرده و تأکید دارد که میتوکندری از باکتری های قدیمی مشتق شده است.
میتوکندری نخستین اندامگان سلولی است که ارتباط آن با بیماری های انسانی مشخص شد. بدین ترتیب که Luft و همکاران در سال 1962 شواهدی مبنی بر بدکاری میتوکندری در بیماران دارای متابولیسم بالا ارایه کردند. درپی آن، گزارش های دیگری مبنی برنقص در زنجیره تنفسی و اختلالات ریخت شناسی در بیماران بــا شکل های مختلف سندرم انسفالومیوپاتی ، آن را تأیید کرد. در 1963، Nass و Nass با کشـــــــف غیر منتظره خود، نشان دادند که میتوکندری دارای DNA ویژه به خود (mitochondrial DNA=mtDNA ) می باشد. در سال 1981، توالی بازی کامـل mtDNA انسان و موش گزارش شد. هر چند که پایه ژنتیکی اختلالات میتوکندریایی تاسال 1988 مبهم بود. دراین سال بود که نخستین جهش بیماریزا در میتوکندری گزارش گردید(1).
کشف مذکور موجب شد که پژوهشها بروی بیماری های میتوکندریایی متمرکز شود و شمــار بیماری هایی که درارتباط با نقص در mtDNA هستند به نحو قابل توجهی – به ویژه در خلال دهة اخیر- افزایش یابد. تاسال 1999 بیش از 50 جهش مختلف با جابجایی باز و بیش از 100 بازآرایی مختلف که موجب بیماری های مختلف درانسان می شود در mtDNA مشخص گردیده است(2). این یافته ها، موجب ایجاد یک انقلاب بزرگ وگشایش حوزه ای جدید در پزشکی به نام پزشکی میتوکندری (Mitochondrial Medicine ) شده است(2). پیشرفت های اخیر در زمینه استفاده از الگو های حیوانی، با آسان کردن مطالعات مولکولی، موجب گسترش اطلاعات و در نتیجه ایجاد داروهای جدید و نیز استراتژی های درمانی نو برای بیماری های میتوکندریایی گردیده است(3).
علی رغم پیشرفت در فهم نقص هایmtDNA در سطح بیوشیمیایی و ژنتیکی، هنوز درمان رضایت بخشی برای توده وسیعی از بیماران در دسترس نیست. بخش عمده این فقدان، به دلیل آن است که تقریبا" تمام نقص های mtDNA به نحوی با متابولیسم اکسیداتیو و تولید ATP همراه هستند و درمان آن توسط یک مسیر فرعی و یا از شیوه وارد کردن این متابولیت ( ATP) به بدن در حال حاضر، غیر ممکن به نظر می رسد. این مسئله، درمان های بیوشیمیایی رابرای بیماران محدود کرده و موجب شده است که دانشمندان به ژن درمانی روی آورند. ژن درمانی در میتوکندری، البته هنوز به شکل نظری و در حد آزمایش های اولیه در الگو های حیوانی مطرح است. هر امکانی برای تعویض ژن به استفاده از ناقلین (vectors ) مناسب انتقال دهنده وابسته می باشد که ژن مورد نظر را وارد اندامگان هدف (میتوکندری) کند(3).
اگر چه در سالهای اخیر پیشرفت های بسیاری در این زمینه به دست آمده است، اما ناقلین جهت دار هنوز در دست بررسی و آزمایش هستند.
دراین مقاله با استفاده از ده ها منبع معتبرو جدید، به طور خلاصه به معرفی میتوکندری، خصوصیات آن، بیماری ها و روش های درمانی موجود برای آن که تا به امروز وجود دارد پرداخته شده اســــت. به علاوه، روشهای ژن درمانی موجود، ویژگی ها، مزایا و معایب هر روش توضیح داده شده است.
ویژگیهای میتوکندری
نیای میتوکندری احتمالا، باکتری های قدیمی بوده اند که در شکل انگل درون سلول یوکاریوت های اولیه زندگی می کرده اند. برخی از رخدادهای صورت گرفته درخلال 5/1 بیلیون سال، موجب حذف یا انتقال اغلب ژنوم باکتری به هسته و تغییر انگل درون سلولی به یک اندامگان کامل وابسته به هسته گردیده است (2). هسته، 80% ژنهای زیر واحدهای مسیر فسفریلاسیون اکسیداتیو و تمام ژنهای لازم برای متابولیسم های حد واسط میتوکندری مانند چرخه کربس، اکسیداسیون اسیدهای چرب ، متابولیسم اسیدهای آمینه، زیست زایی (biogenesis ) ویتامین ها و پروتئین های لازم برای میتوکندری را داراســت (4) . در نتیجه چون منشاء آن یک همزیست قدیمی است ژنهای آن با ژنهای هسته، تفاوت هایی در فرایندهایی مانند همانندسازی، رونویسی و ترجمه دارا می باشد. ازنظر کلید های رمز ژنتیکی و عوامل لازم برای اعمال مختلف بین میتوکندری با هسته تفاوتهایی وجوددارد. این واقعیت موجب می شودکه سنتزپروتئین آن به آنتی بیوتیک هایی که این عمل را در پروکاریوت ها مهار می کند، ونیز به آنتی بیوتیک هایی که ترجمه سیتوزولی یوکاریوت ها را مهار می کند حساس باشد(5).
میتوکندری، یک اندامگان کوچک درون سیتوپلاسمی با اندازه 1-5/0 میکرومتر است که در سیتوپلاسم سلول های هسته دار یوکاریوتی یافت می شود و دارایDNA مربوط به خـــود (mtDNA) می باشد ( 1 ).
میتوکندری ها به طور قابل توجهی کشایند (elastic) و متحرک بوده و شکل آن قابل تغییر است. نیز، قابلیت با هم یکی شدن و دوباره از هم جدا شدن را دارند. حرکت آنها توسط میکروتوبول ها (microtubules ) تنظیم می شود و این امر موجب توزیع میتوکندری به سلول های متفاوت می گردد. همچنین، دارای دو غشاء (درونی و بیرونی) وماتریکس بین دوغشاء و ماتریکس درونی می باشند. غشاء خارجی به مولکول های کوچک تاKD 10نفوذ پذیر است و درنتیجه تولید یک فضای بین غشائی می کند که از نظر شیمیایی (به ویژه مولکول های کوچک) معادل سیتوزول می باشد. غشاء درونی تنها بــه 2O و 2Co نفوذپذیر است. نفوذناپذیری امری مهم و حیاتی است که موجب حفظ شیب پروتون تولیدی به هنگام انتقال الکترون درطول زنجیره تنفسی می گردد. شیب پروتون برای تولیدATP لازم و ضروری است. تولید ATP و انرژی سلولی مهمترین واصلی ترین نقش میتوکندری محسـوب می شود( 1 ).
غشاء درونی دارای کریستاها و شیارهایی است که موجب افزایش سطح غشا برای انجام واکنش های زنجیره تنفسی می شود. این کریستاها می تواند ساختار لوله ای ساده یا پیچیده ( صفحه ای، مجرایی) را نشان دهند( 6 ). غشاء درونی دارای مجموعه یا کمپلکس های زنجیره تنفسی می باشد و در نتیجه حجم بالایی از پروتئین های غشائی غیرمعمول را داراست. به علاوه دارای انواع پروتئین های انتقال دهنــــده (ناقل) می باشد. ماتریکس یا فضای درونی شامل mtDNA ، ریبوزوم و پروتئین های لازم برای همانندسازی، رونویسی، ترجمه mtDNAونیز آنزیم ها و متابولیت های لازم برای دیگرفعالیت های میتوکندری (از جمله چرخه کربس، بتااکسیداسیون اسید های چرب، متابولیسم اسیدهای آمینه، زیست زایی ویتامین ها و ریبوزوم)، است. مواد غذایی درون ماتریکس اکسید شده و نتیجه آن احیا کمک عامل ها و انتقال الکترون ها به مجموعه های آنزیمی در غشاء درونی می باشد. خارج شدن الکترون توســط سه عدد از این مجموعه ها، ایجاد شیب پروتون و در نتیجه تولید ATP می کند (1 ).
از آنجا که میتوکندری مرکز مهم متابولیسم سلولی است و در بسیاری از مسیرهای متابولیکی درگیر است، معمولا" بخش وسیعی از حجم سلول را اشغال می کند. سلول های انسانی بسته به نیاز خود به انرژی، از چند تا چندین هزار میتوکندری رادارا می باشند. ازدیاد میتوکندری توسط تقسیم دوتایی است. در نتیجه هر میتوکندری از میتوکندری پیشین حاصل می شود( 4) .
ژنتیک میتوکندری : A Genetic Pandora’s Box
در اساطیرآمده است که مردی غول پیکر به نام Prometheus به دلیل دزدیدن آتش از خدا، محکوم به زندگی در صخره های قفقاز شد. خداوند برای تنبیه او بشر فانی یعنی زنی زیبا به نام Pandora را برای او فرستاد که تنها ضعف او کنجکاوی او بود. جعبه ای به رسم امانت به Pandora سپرده شده بود و اوقسم یادکرده بود که هرگز آن را باز نکند . اما به دلیل کنجکاوی، پاندورا آن جعبه را باز کرد و به محض بازشدن جعبه، تمام شیاطین از جعبه بیرون آمدند و در اطراف جهان پخش شدند. اما مناسبت مقایسةmtDNA به جعبه پاندورا تنها به دلیل بیماریهای فراوانی نیست که مسبب آن DNA حلقه ای میتوکندری می باشد، بلکه بدان جهت است که جعبه پاندورا توسط یک زن آورده شد و mtDNA نیز توسط مادر به فرزند انتقال می یابد. از طرفی Prometheus، به بشرآتش بیرونی (منبع روشنایی و گرما) را هدیه کرد در حالی که پاندورا آتش درونی (شیاطین و وسوسه های آنها ) را ارایه کرد و چنانچه می دانیم میتوکندری منبع انرژی درونی سلول می باشد( 3 ).
هرمیتوکندری دارای 2 تا 10 نسخه از DNA است. درنتیجه به طورمعمول هرسلول دارای 104 – 103 نسخه ازmtDNA می باشد. اندازه mtDNA در پستانداران بین 16 تا 18 کیلوباز متغیر است. mtDNAانسان، مولکول حلقوی دو رشته به اندازه bp 16569 می باشد. فاقد اینترون است و ژنهای آن ) شامل 37 عدد) بسیار فشرده و به هم چسبیده بوده یا اینکه تنها توسط چند نوکلئوتید از هم جدا شده اند. 2 ژن آن رمز کننده rRNA (s rRNA16s rRNA, 12) ، 22 ژن رمز کننده tRNA و 13 ژن آن رمز کننده پلی پپتیدهایی می باشد که همگی از ترکیبات زنجیرة تنفسی (فسفریلاسیون اکسیداتیو) هستند. زنجیره تنفسی دارای 5 مجموعه یا کمپلکس آنزیمی است که این مجموعه ها شامل 100 زیر واحد پروتئینی متفاوت است.
زیر واحدهایی که توسط mtDNA رمزدهی می شود، مشتمل بر موارد زیر است:
الف) 7 زیر واحد از 39 زیرواحد مجموعة یک به نام NADH دهیدروژنازیوبی کینون اکسید وردوکتاز
(NADH dehydrogenase-ubiquinone oxidoreductase ( : ND1, ND2 , ND3, ND4L , ND5, ND6 , ND4
ب) 1 زیر واحد از 10 زیرواحد مجموعة 3 به نام یوبی کینون سیتوکروم C اکسیدورودوکتاز
(ubiquinone-cytochrome C oxidoreductase) : سیتو کرومb یا Cytb
ج) 3 زیرواحدد از 13 زیرواحد مجموعة 4 تحت عنوان سیتوکروم C اکسیداز یا COX
(cytochrome C oxidase) : CoI , CoII,CoIII
د) 2 زیرواحد از 12 زیرواحد مجموعة 5 به نام ATP سنتتاز ( ATP synthetase) : ATP ase 6 وATPase 8
شایان ذکر است که تمام چهار زیرواحد مجموعة 2 با عنوان سوکسینات دهیدروژنازیوبی کینون اکسیدوردوکتاز(succinate dehydrogenase-ubiquinone oxidoreductase)، انحصارا توسط DNAی هسته ( nDNA nuclear DNA=) رمزدهی می شود ( 4) .
از آنجاکه 13 ژن، پلی پپتیدهای زنجیره تنفسی و 24ژن دیگر نیز RNA ها را که در سنتز پروتئین نقش دارند، رمزدهی می کنند، جهش و از بین رفتن فعالیت هر بخشی از mtDNA موجب می شود که سلول بیش از پیش ظرفیت سنتز ATP خود را ازدست بدهد (1 ).
باقیمانده زیرواحدهای این مجموعه ها توسط nDNA رمزدهی شده و در سیتوپلاسم ترجمه می گردند و از آنجا وارد میتوکندری می شوند و با زیر واحدهایی که توسط mtDNA رمزدهی می شود مجتمع می شوند. پروتئین های رمز شده توسط هسته، دارای پپتید یا علامت راهنما با بار مثبت در انتهای آمین خود می باشند که موجب هدایت آنها توسط این علامت به سوی میتوکندری گردیده و سپس به گیرنده مربوط به خود متصل شده و ازبین غشاء عبور می کنند. این پیتید راهنما پس از انتقال پروتئین به میتوکندری، توسط پروتئازها جدا می شود. به طور کلی حدود 1000 پروتئین میتوکندریایی متفاوت توسط ژنوم هسته ای رمزدهی می گردد. بنابراین جهش در ژنهای هسته ای می تواند بسیاری از اعمال میتوکندری را مختل کند( 5 ).
دو رشتة mtDNA از نظر محتوای بازی باهم متفاوت هستند. رشته سنگین (heavy=H) بیشتر دارای G و رشتة سبک (light=L) بیشتر د ارای C می باشد. عمل رشتة H الگو برداری s rRNA16 و s12 و 12 پلی پپتید و 14 عدد tRNA است. رشته L، الگوبرداری پلی پپتیدND6 و 8 عددtRNA را برعهده دارد. هررشته دارای یک نقطه شروع همانندسازی مربوط به خود است که فاصله دو منطقه همانندسازی (مربوط به دورشته) به اندازه دوسوم ژنوم می باشد. از نظر کنترلی، نقطه شروع همانندسازی رشته H، در منطقه مهمی قرار گرفته است که به آن حلقة D (Displacement ) گویند و تنها ناحیة غیر رمزدار در mtDNA است. ناحیة حلقة D شامل پروموتر(promoter=P) برای رونویسی هر دورشته mtDNA می باشد. پروموتر مربوط به رشتهH از نوکلئوتید567-547 وپروموتر مربوط به رشته L، ازنوکلئوتید 445-392 می باشد. همچنین، سه توالی حفظ شده 363-346:,CSBIIT 315-299 CSBII:و 235-213: CSBIو توالی TAS ( Termination Associated Sequence) یا 16172-16147 نیز دراین ناحیه قرار گرفته است. حلقة D یک منطقه سه رشته ای را شکل می دهد که رشته سوم یک قطعه جدیدH به نام Vs DNA می باشد. Vs DNA با استفاده از پرایمرRNA، از منطقه PL رونویسی شده وتانزدیک CSBII پیش رفته و سپس توسط RNA ase میتوکندریایی به نامMRP، که عمل آن پردازش RNA است، شکافته می شود. سنتز Vs DNA ازCSBII شروع می شود و در TAS ختم می گردد. اندازه آن np 700 است . سنتز رشته H از VsDNA شروع می شود ودرجهت عقربه ساعت ادامه یافته و زمانی که دوسوم ژنوم را طی کرد به منشاء همانندسازی رشته L ( 5798-5721OL, np ) می رسد. سنتز رشتهL نیز با یک پریماز ویژه که s rRNA8/5 سیتوزولی است شروع می شود و جهت سنتز آن در خلاف جهت رشته H و در طول رشته H آزاد شده می باشد. بنابراین همانندسازی دوجهته اما غیر همزمان است. از آنجا کهmtDNA ابرمارپیچ (super-coiled ) است، همانند سازی و رونویسی می تواند توسط برومیداتیدیوم (ethidium bromide ) مهار شود .
ژنوم میتوکندری ، فاقد اینترون بوده و بسیار فشرده می باشد و اغلب mRNA های آن فاقد توالی های ترجمه نشدنی انتهای ´5 و ´3 می باشند . درابتدای mRNA ها ، کلید رمز آغاز کننده ودرانتهای آنها کلید رمز ایست قرار دارد و پایانة پلی A پس از رونویسی به آنها اضافه می شود. رونوشت رشته H، تولید مقادیر زیادی رونوشت rRNA می کند.
مانند باکتری ها، سنتز پروتئین در میتوکندری، بااسیدآمینه فرمیل متیونین شروع می شود. عوامل طویل کننده آن مشابه باکتری هاست و به مهار کننده های ریبوزوم باکتری چون کلرامفنیکل (chloramphenicole=CAP ) حساس می باشد. شایان ذکر است که میتوکندری با دیگر اندامگان ها در داشتن کلیدهای رمز ژنتیکی متفاوت است، به طور مثال درمیتوکندری کلیدهای رمز ایست UGA و UGG برای تریپتوفان و کلیدهای رمز مربوط به آرژنین یعنی AGA و AGG برای ختم زنجیره استفاده می شود. چون اغلبmRNAهای میتوکندریایی دارای شمار زیادی از کلید UGA هستند، از این رو در سیتوپلاسم نمی توانند ترجمه شوند، در نتیجه این تفاوت در کلیدهای رمز ژنتیکی موجب می شود که تنها در میتوکندری ترجمه گردند (4 ).
میتوکندری دارای DNA پلیمرازگاما (ﻻ) ونیز عوامل رونویسی ویژه مانند mt TFA (نام دیگرآن Tfam ) می باشد که این دو پروتئین توسط هسته رمزدهی شده و سپس وارد میتوکندری می شوند. میتوکندری، همچنین واجد دیگر پروتئین های لازم برای همانند سازی مانند DNA پریماز، توپوایزومراز نوع 1و2، هلیکاز، پروتئین های متصل شونده به DNA تک رشته ای، DNA وRNA اندونوکلئازها و نوکلئوزید کینازها می باشد( 4 ).
تفاوت ژنتیک میتوکندریایی باژنتیک مندلی:
ژنتیک میتوکندریایی با ژنتیک مندلی از جهات متعددی ، به ویژه موارد زیر متفاوت است:
توارث مادری:
تخم دارای صد هزار mtDNA است در حالی که اسپرم تنها چندصد عدد دارد. به هنگام لقاح، تمام میتوکندری تخم و در نتیجه mtDNA از طریق اووسیت دریافت می شود، بنابراین مادری که دارای جهش در mtDNA می باشد آن را به تمام
تحقیق درباره ژنتیک مولکولی و ژن درمانی در بیماریهای میتوکندریایی
